چطور آسپرین با محدود کردن TXA2 از پلاکت ایمنی جلوگیری میکند ؟

متاستاز به گسترش سلول‌های سرطانی از تومورهای اولیه به اندام‌های دور اطلاق می‌شود و علت ۹۰ درصد مرگ‌ومیرهای ناشی از سرطان در سطح جهانی است. سلول‌های سرطانی متاستاتیک به طور منحصر به فردی در برابر حمله سیستم ایمنی آسیب‌پذیر هستند، زیرا در ابتدا از محیط ایمونوساپرسیو موجود در تومورهای تثبیت‌شده محروم می‌شوند. این موضوع علاقه‌ای را برای بهره‌برداری درمانی از این آسیب‌پذیری ایمنی به منظور جلوگیری از عود در بیماران مبتلا به سرطان اولیه در معرض خطر متاستاز ایجاد کرده است. در این مطالعه نشان می‌دهیم که مهارکننده‌های سیکلواکسیژناز ۱ (COX-1)، از جمله آسپرین، ایمنی به متاستاز سرطان را با آزادسازی سلول‌های T از سرکوب توسط ترومبوکسان A2 (TXA2) مشتق از پلاکت‌ها افزایش می‌دهند. TXA2 بر روی سلول‌های T عمل می‌کند تا یک مسیر ایمونوساپرسیو وابسته به فاکتور مبادله گوانین ARHGEF1 را فعال کند، که باعث سرکوب سیگنال‌دهی کیناز، تکثیر و عملکردهای اثرگذار ناشی از گیرنده سلول T می‌شود. حذف شرطی خاص سلول‌های T از Arhgef1 در موش‌ها، فعال‌سازی سلول‌های T در محل متاستاز را افزایش می‌دهد و باعث رد ایمنی متاستازهای ریه و کبد می‌شود. در نتیجه، محدود کردن دسترسی به TXA2 با استفاده از آسپرین، مهارکننده‌های انتخابی COX-1 یا حذف خاص پلاکتی COX-1، میزان متاستاز را به شکلی کاهش می‌دهد که وابسته به بیان ذاتی ARHGEF1 در سلول‌های T و سیگنال‌دهی TXA2 در بدن است. این یافته‌ها یک مسیر ایمونوساپرسیو جدید را نشان می‌دهند که ایمنی سلول‌های T به متاستاز سرطان را محدود می‌کند، بینش‌های مکانیستی در مورد فعالیت ضد متاستازی آسپرین ارائه می‌دهد و راه را برای ایمونوتراپی‌های ضد متاستازی مؤثرتر هموار می‌کند.

زمینه

علیرغم پیشرفت‌ها در درمان سرطان اولیه، بسیاری از بیماران تحت درمان برای سرطان‌های مرحله اولیه، ماه‌ها تا سال‌ها بعد دچار عود متاستاتیک می‌شوند که به دلیل رشد نهایی میکرومتاستازهای منتشر شده است. میکرومتاستازها در برابر حمله سیستم ایمنی آسیب‌پذیر هستند، زیرا از محیط بسیار ایمونوساپرسیو موجود در تومورهای تثبیت‌شده محروم می‌شوند. این موضوع فرصتی را برای درمان‌های ضد متاستازی ایجاد می‌کند که از سیستم ایمنی برای جلوگیری از عود در بیماران مبتلا به سرطان اولیه در معرض خطر متاستاز استفاده می‌کنند.

آسپرین یک مهارکننده غیرقابل برگشت آنزیم‌های COX است. متاآنالیزهای آزمایش‌های کنترل‌شده تصادفی بزرگ نشان داده‌اند که درمان روزانه با آسپرین با کاهش متاستاز در چندین محل در افراد مبتلا به سرطان مرتبط است. علاوه بر این، درمان با دوز کم آسپرین (۷۵-۳۰۰ میلی‌گرم) با کاهش میزان مرگ‌ومیر ناشی از سرطان در افرادی که در زمان تشخیص سرطان متاستاز نداشته‌اند، مرتبط است. در سرطان کولورکتال، ارتباط استفاده از آسپرین با بهبود بقا به نظر می‌رسد محدود به تومورهایی است که سطوح بالایی از آنتی‌ژن لکوسیت انسانی (HLA) کلاس I را بیان می‌کنند، که نشان می‌دهد اثر آن دارای یک جزء ایمنی است. COX-1 (همچنین به عنوان پروستاگلاندین G/H سنتاز ۱ شناخته می‌شود) به طور کلی در بیشتر بافت‌ها، از جمله در پلاکت‌ها، که برای تولید TXA2 لازم است، بیان می‌شود، در حالی که COX-2 عمدتاً در طول التهاب القا می‌شود. آسپرین نیمه عمر کوتاهی دارد (حدود ۲۰ دقیقه)، به طوری که فقط دوزهای مکرر و بالای آسپرین می‌توانند مهار فارماکولوژیک پایدار COX-1 و COX-2 را در سلول‌های هسته‌دار ایجاد کنند. در مقابل، آسپرین با دوز کم روزانه عمدتاً COX-1 پلاکت‌ها را هدف قرار می‌دهد و در نتیجه تولید TXA2 را مهار می‌کند، زیرا پلاکت‌های بدون هسته نمی‌توانند مخزن COX-1 خود را که به طور غیرقابل برگشت مهار شده‌است، بازسازی کنند. به طور کلی، این نتایج نشان‌دهنده رابطه بین ایمنی سلول‌های T، سرکوب TXA2 پلاکت‌ها و فعالیت ضد متاستازی آسپرین است، اما رابطه مستقیم بین این موارد هنوز مشخص نشده است.

در این مطالعه نشان می‌دهیم که TXA2 پلاکت‌ها ایمنی به متاستاز سرطان را با فعال‌سازی یک مسیر ایمونوساپرسیو ذاتی سلول‌های T که وابسته به فاکتور مبادله گوانین ARHGEF1 است، سرکوب می‌کند. در نتیجه، محدود کردن دسترسی به TXA2 با استفاده از آسپرین، مهارکننده‌های انتخابی COX-1 یا حذف خاص پلاکتی COX-1، میزان متاستاز را به شکلی کاهش می‌دهد که وابسته به بیان ذاتی ARHGEF1 در سلول‌های T و سیگنال‌دهی TXA2 در بدن است. این یافته‌ها یک مسیر ایمونوساپرسیو جدید را نشان می‌دهند که ایمنی سلول‌های T به متاستاز سرطان را محدود می‌کند، بینش‌های مکانیستی در مورد فعالیت ضد متاستازی آسپرین ارائه می‌دهد و راه را برای توسعه ایمونوتراپی‌های ضد متاستازی مؤثرتر هموار می‌کند.

ARHGEF1 ایمنی سلول‌های T به متاستاز را سرکوب می‌کند

ما قبلاً یک غربال‌سازی ژنتیکی بزرگ در بدن انجام دادیم تا تنظیم‌کننده‌های میزبان متاستاز سرطان را شناسایی کنیم. این غربال‌سازی ۱۵ ژن را شناسایی کرد که اختلال در آن‌ها در بافت‌های میزبان، فراوانی متاستازهای ریه را پس از تزریق داخل وریدی سلول‌های ملانومای B16 هم‌ژن کاهش می‌داد، از جمله ژن کدکننده فاکتور مبادله گوانین RHO با وزن ۱۱۵ کیلو دالتون ARHGEF1. با تأیید نتایج غربال‌سازی اولیه با استفاده از کنترل‌های هم‌زاد، کاهش تعداد متاستازها را در ریه‌های موش‌های فاقد Arhgef1 در مقایسه با کنترل‌های وحشی پس از تزریق داخل وریدی سلول‌های ملانومای B16 هم‌ژن مشاهده کردیم. این موضوع با کاهش فراوانی سلول‌های توموری برچسب‌خورده با mCherry در ریه‌های موش‌های فاقد Arhgef1 پس از تزریق داخل وریدی سلول‌های ملانومای B78ChOva مطابقت داشت. به طور مشابه، کاهش میزان متاستاز ریه را پس از تزریق داخل وریدی سلول‌های کارسینومای ریه لوئیس LL/2 هم‌ژن به موش‌های فاقد Arhgef1 مشاهده کردیم. کاهش میزان متاستاز پس از از دست دادن ARHGEF1 محدود به ریه‌ها نبود، زیرا کاهش تعداد متاستازهای کبدی را نیز پس از کاشت داخل طحالی سلول‌های B16 در موش‌های فاقد Arhgef1 مشاهده کردیم.

موش‌های دارای جهش زاینده MMTV-PyMT، سرطان‌های اولیه پستان را ایجاد می‌کنند که به طور خودبه‌خودی به ریه‌ها متاستاز می‌دهند. اگرچه تفاوت عمده‌ای در رشد تومورهای اولیه پستان در موش‌های فاقد Arhgef1 در مقایسه با کنترل‌های وحشی در پس‌زمینه MMTV-PyMT مشاهده نکردیم، اما کاهش فراوانی ندول‌های متاستاتیک را در ریه‌های موش‌های فاقد Arhgef1، زمانی که موش‌های با تومورهای اولیه پستان با اندازه مشابه تحلیل شدند، مشاهده کردیم. مشابه عدم تأثیر عمده بر رشد تومورهای اولیه پستان MMTV-PyMT، کمبود ARHGEF1 تأثیر کمی بر رشد تومورهای آدنوکارسینومای کولورکتال MC38 هم‌ژن کاشته‌شده زیرپوستی داشت. این یافته‌ها نشان داد که از دست دادن بیان ARHGEF1 در بافت‌های میزبان، توسعه متاستازهای سرطان را در چندین محل متاستازی کاهش می‌دهد.

ARHGEF1 عمدتاً در سلول‌های رده خون‌ساز بیان می‌شود. تفاوت عمده‌ای در فراوانی رده‌های خون‌ساز بالغ در ریه‌های حامل تومور موش‌های فاقد Arhgef1 در مقایسه با کنترل‌های وحشی مشاهده نکردیم. با این حال، دریافتیم که از دست دادن ARHGEF1 در سلول‌های خون‌ساز برای ایجاد اثر ضد متاستازی مشاهده‌شده کافی است، زیرا موش‌های وحشی تحت تابش کشنده که با سلول‌های خون‌ساز مغز استخوان از موش‌های فاقد Arhgef1 بازسازی شده‌بودند، کاهش فراوانی متاستازهای ریه B16 را در مقایسه با موش‌های بازسازی‌شده با سلول‌های خون‌ساز وحشی نشان دادند. کلونیزاسیون متاستاتیک ریه‌های موش‌های فاقد Arhgef1 با افزایش بیان ژن‌های مرتبط با فعال‌سازی ایمنی و عملکرد سیتوتوکسیک، از جمله Ccl4، Nkg7، Gzma، Gzmb، Cxcl5 و Klrg1، در مقایسه با کنترل‌های وحشی همراه بود. این یافته‌ها ما را به این فرضیه رساند که ARHGEF1 یک اثر ایمونوساپرسیو در سلول‌های رده خون‌ساز اعمال می‌کند.

برای تعیین انواع سلول‌های خون‌سازی که ARHGEF1 عملکرد ایمونوساپرسیو خود را در آن‌ها اعمال می‌کند، یک آلل موشی Arhgef1 فلوکسی (از این پس Arhgef1fl) ایجاد کردیم که امکان حذف شرطی ARHGEF1 در رده‌های سلولی خاص پس از نوترکیبی Cre-medi را فراهم می‌کند. موش‌های Arhgef1fl/fl را با موش‌های Ncr1cre، Lyz2cre و Cd4cre تلاقی دادیم که امکان تجزیه و تحلیل از دست دادن عملکرد ARHGEF1 را در سلول‌های خون‌ساز رده سلول‌های کشنده طبیعی (NK)، ماکروفاژ و سلول‌های T به ترتیب فراهم می‌کند. در حالی که حذف خاص سلول‌های NK و ماکروفاژ ARHGEF1 منجر به کاهش فراوانی متاستازهای ریه پس از تجویز داخل وریدی سلول‌های ملانومای B16 نشد، دریافتیم که حذف خاص سلول‌های T از ARHGEF1 در موش‌های Arhgef1fl/fl Cd4cre (از این پس موش‌های Arhgef1-cKO) باعث کاهش قابل توجه متاستاز ریه در مقایسه با کنترل‌های Arhgef1+/+ Cd4cre (از این پس cWT) شد، که مقاومت به متاستاز مشاهده‌شده در موش‌های فاقد ARHGEF1 در همه بافت‌ها را بازتولید کرد.

از دست دادن ARHGEF1 عملکرد سلول‌های T را افزایش می‌دهد

چندعملکردی سیتوکینی یک نشانه از پاسخ‌های ایمنی مؤثر ضد ویروسی و ضد توموری است. برای درک بهتر چگونگی کنترل متاستاز ریوی توسط سلول‌های T فاقد ARHGEF1، سلول‌های T نفوذکننده به ریه را با استفاده از فلوسیتومتری تحلیل کردیم. اگرچه تعداد مشابهی از سلول‌های CD4+ و CD8+ T در ریه‌های حامل تومور موش‌های cWT و Arhgef1-cKO یافت شد، رنگ‌آمیزی سیتوکین داخل سلولی سلول‌های T از ریه‌های حامل تومور نشان داد که فراوانی سلول‌های چندعملکردی که دو یا چند سیتوکین از جمله IFNγ، IL-2 و TNF را هم‌زمان بیان می‌کنند، در موش‌های Arhgef1-cKO در مقایسه با موش‌های cWT به طور قابل توجهی افزایش یافته است. خستگی سلول‌های T با کاهش چندعملکردی سیتوکینی و فعالیت ضد توموری همراه است. با تحلیل فنوتیپ سلول‌های T در ریه‌ها با استفاده از فلوسیتومتری چندبعدی، دریافتیم که کلونیزاسیون متاستاتیک جمعیت‌هایی از سلول‌های CD4+ و CD8+ T را القا می‌کند که سطوح بالایی از نشانگر خستگی PD-1 را بیان می‌کنند، از جمله سلول‌های کاملاً خسته TIM3+TIGIT+TOX+CD39+TCF1low (خوشه ۱۰) و سلول‌های پیش‌ساز خسته SLAMF6+TIM3−TIGIT−TCF1hi (خوشه ۱۴)، که فراوانی آن‌ها در موش‌های Arhgef1-cKO در مقایسه با موش‌های cWT کاهش یافته بود. قابل توجه است که افزایش چندعملکردی سیتوکینی و کاهش بیان نشانگرهای خستگی PD-1 و TOX را در میان سلول‌های CD8+ T خاص آنتی‌ژن تومور که به OVA بیان‌شده توسط متاستازهای B78ChOva در ریه‌های موش‌های Arhgef1-cKO پاسخ می‌دادند، مشاهده کردیم.